CAR-T細胞療法生產綜述

3 3 月, 2023

簡介

在過去的幾十年中，細胞療法已成為治療惡性腫瘤的一種有前途的新方法，只能在姑息治療的基礎上治療。在這些療法中，嵌合抗原受體（CAR）修飾的T細胞療法被證明對血液系統惡性腫瘤有效[1]。為了產生CAR T細胞，修飾患者來源的（自體的）或供體來源的（同種異體的）T細胞以表達CAR。CAR是嵌合構建體，其含有至少一個T細胞受體的信號傳導結構域和單鏈可變片段（scFv）[2]。

最近的估計計算使用當前製造方法產生的CAR T細胞治療產品的總成本為150 000-300 000美元，而Novartis的Kymriah超過這些估計每次治療花費475 000美元[3]。因此，特別重要的是要認識到主要的成本驅動因素和流程規模，以及製造戰略的當前趨勢。

本綜述旨在概述CAR T細胞療法的製造，同時考慮工藝規模和經濟性。目前公布的CAR T細胞治療臨床試驗進行了研究，以分析CAR T細胞產品的製造策略（圖1）。

迄今為止，大多數臨床試驗已經應用了現成的加工設備，但是對於它們最小化運行間差異和生產成本的能力存在重大擔憂。未來的趨勢將是採用新的技術，提供自動化和集成的封閉式製造解決方案，引領該領域走向低成本製造工藝。

圖1目前CAR T細胞治療和產品的特點

已公開發表的生產技術

許多臨床I期和II期研究的結果很有希望，首批CAR T細胞產品諾華公司的Kymriah和KITE Pharma的Yescarta已獲批准。然而，研究和開發仍然沒有創造一個成熟的、完全被理解的過程。許多CAR T產品是使用手工加工製造的，這種加工是勞動密集型，難以擴展並且容易出現高故障率[4,5]。這主要是由於CAR T治療個性化特徵以及缺乏針對細胞治療定制的小規模生產技術，以及需要快速生產用於早期試驗的材料。生產過程始終包含與圖2中相同的常見步驟。

圖2 CAR T細胞製造過程的流程圖

洗滌單採血液成分產物以除去白細胞分離期間添加的抗凝血劑，然後通過細胞培養基中的T細胞活化途徑刺激活化。可溶性單克隆抗體，包被的磁珠或人工抗原呈遞細胞經常用於活化。通過慢病毒或逆轉錄病毒和非病毒方法（例如轉座子/轉座酶系統）將CAR轉基因遞送到細胞中。然後將細胞在靜態或動態培養容器或裝置中擴增至所需的細胞數。最後，根據配方調整細胞數量和培養基組成（如果產品是冷凍的，需要冷凍保存培養基），然後將產物轉移到合適的容器中進行遞送或冷凍。虛線表示系統邊界或進行工藝步驟的容器的物理屏障;箭頭表示轉移步驟。

1.白細胞分離，細胞洗滌和富集

1.1白細胞分離術和細胞洗滌

T細胞療法開始於通過白細胞分離法獲得患者的WBC，這是一種將白細胞與全血分離的單採血液成分術。血液成分通常用密度梯度介質通過連續或間歇離心方法來分離。

在血液成分分離過程中添加的抗凝血劑，紅細胞和血小板算是污染物，通常會在洗滌步驟中除去。抗凝劑可能在激活過程中改變細胞的行為[6]，紅細胞可以影響臨床療效，血小板可以導致細胞聚集[7,8]。為了去除紅細胞和血小板，在早期報告中應用手動Ficoll密度梯度離心，並且在最近的臨床試驗中再次應用（NCT01886976;NCT01864902）[9]。或者，自動細胞清洗器，如COBE 2991細胞處理器[12]（NCT02215967），Haemonetics CellSaver[13]，已停產的Baxter Cytomate[14]（NCT00466531，NCT01044069），Biosafe使用Sepax II[15,16]（NCT00968760，NCT01497184，NCT01362452）或消耗單核細胞的CaridianBCT Elutra[17]（NCT01029366）。洗滌後，WBC可直接使用或冷凍在可控速率的冷凍機中，如Cryomed[14]。

1.2富集和消耗

一些組使用CliniMACS系統富集或消耗特定細胞亞群，其中相應的抗體與順磁珠連接。Fred Hutchinson癌症研究中心和西雅圖兒童醫院為CD4+（T輔助細胞）和CD8+（細胞毒性T細胞）富集WBCs，以便輸入具有確定的CD8+/CD4+細胞比例的產品（Gardner等人，2014，Turtle等人.2014，2015a，2015b；）。同樣，布朗等人（2016）選擇產生富含中樞記憶T細胞（CD62L+）的治療。來自MD安德森癌症中心的Singh及其同事發現，大量的自然殺傷（NK）細胞阻礙了T細胞培養[15]。如果NK細胞數量超過10％，他們使用CD56+磁珠進行NK耗竭。拉莫斯等人（2013）在具有>95％循環白血病細胞的兩名患者中進行CD3+選擇，以使得能夠從含有低百分比的T細胞的單採血液成分產物中擴增。

2.激活

在體內，通過抗原呈遞細胞（例如樹突細胞（DC））刺激天然T細胞的增殖和分化。T細胞通過T細胞受體（TCR）與位於DC細胞表面的主要組織相容性複合物之間的相互作用以及通過共刺激分子如CD28，4-1BB和OX40激活[18]。為了避免與DC共培養繁瑣的過程，已經開發並實施了幾種模擬T細胞天然刺激的方法[13]。

2.1單克隆抗體和白細胞介素

常見的方法是加入OKT3（抗CD3單克隆抗體（mAb））和白細胞介素（IL）-2。與輻照的健康供體外周血單核細胞（PBMC）和淋巴母細胞樣細胞系（LCL；人EB病毒（EBV）感染的PBMCs）同時共培養[19]有時被稱為「快速擴增方案」[20]。Gattinoni等人的研究顯示，從一次試驗到下一次試驗，使用的IL-2濃度差別很大[21]。這些研究表明IL-2的使用，特別是濃度過高，可導致T細胞耗盡，進入功能障礙階段，效應功能較差，並迅速接近細胞凋亡[22]。巴雷特[23]和Ghassemi等人[24]發現用IL-7和IL-15替換IL-2導致更高百分比的記憶子集。

2.2細胞大小的抗CD3/CD28抗體包被的磁珠

Kalos等[17]使用抗CD3/CD28抗體包被的磁珠作為人工抗原呈遞顆粒，併發現與這些相比，用這些激活的細胞可以比OKT3/IL-2更能保留其記憶表型的細胞。如Hollyman等人[14]所示，超順磁珠的直徑為4.5mm，並且用強電磁鐵有效地除去，在生產結束時每3×106個細胞留下<100個殘留珠。在擴增期間，磁珠用於連續刺激細胞。這表明使用磁珠激活更強的活化[13,25]與其他方法（如用抗CD3抗體和IL-2激活）相比，細胞因子的產生高10-100倍。塗有抗體的順磁珠也具有幾個加工優點。通過磁性保留與細胞結合的珠子，更容易促進細胞培養步驟如洗滌和富集。磁珠可用於細胞的選擇和活化，而無需在收穫之前將其除去。灌注或介質交換是可能的，而不會損失大量昂貴的刺激抗體，因為它們會與磁珠偶聯。研究表明，與用OKT3（抗CD3mAb）和IL-2激活相比，用抗CD3/CD28珠子激活導致更少消耗並因此更持久的T細胞[23]。

2.3人工抗原呈遞細胞

在最近的一些臨床研究中，CAR-T細胞被非活力的抗原呈遞細胞激活，例如K562細胞系共表達所需的刺激分子和腫瘤相關抗原（TAA）[16]。輻照後，死細胞符合當前的良好生產規範（cGMP）。它們不表達人白細胞抗原A和B，並選擇性地刺激TAA特異性的CAR T細胞[16,26]。為了產生具有EBV特異性TCR的CAR T細胞，EBV轉化的LCL用於激活[27]。

2.4在當前臨床試驗中激活

我們調查了不同技術在臨床試驗中使用的產品的使用頻率（列於表1）。據我們所知，本研究分析了2002年至2017年9月發表的所有試驗數據。如果沒有指定患者數量，或者出版物中沒有詳細說明過程技術和產品特徵，則不包括在此分析中。術語「可評估產品」描述了給予一名患者的產品，並且報告為以某種方式激活，轉導或擴展。報告含有模糊或無數據的CAR T細胞產品不是「可評估產品」。沒有任何製造過程細節的報告被排除在外。總的來說，已經分析了1000名患者的產品製造數據。

激活T細胞的主要方法是用抗CD3/CD28抗體包被的順磁珠激活，其中956種為可評估產品中的626種。抗CD3/CD28 mAb和IL-2佔952種可評價產品中的279種，其中107種是用KITE Pharma的KTE-019（現在批准為Yescarta）。在評論的研究中報告使用磁珠的第一組是Deeks等[28]在針對HIV的抗gp120 CAR T細胞的研究中。使用該方法的大量研究與Novartis和Juno Therapeutics產品CTL019（現已批准為Kymriah）和JCAR014，JCAR015，JCAR017和JCAR018相關。

3.基因傳遞

基因遞送可分為病毒和非病毒方法。在CAR T細胞療法中，裸DNA的電穿孔，基於質粒的轉座子/轉座酶系統和病毒載體，特別是逆轉錄病毒或慢病毒已經應用於基因遞送（表1）。

3.1病毒轉導

逆轉錄病毒或慢病毒基因轉移可以產生高轉導效率（在所研究的研究中任何地方為4％至70％[11,29]）但是比質粒轉染顯著更昂貴。使用逆病毒或慢病毒的高效轉導需要激活T細胞。特別是在僅轉導分裂細胞的逆轉錄病毒中，增殖對於基因遞送是必需的。使用這兩種方法，存在致癌基因插入的風險，而慢病毒整合在理論上不太可能發生[30]。然而，就我們所知，在CAR T細胞療法的臨床上沒有此類案例的報導。

病毒基因遞送方法需要包裝細胞系用於病毒載體的cGMP生產。這是勞動密集型且昂貴的，主要是因為載體生產必須在單獨的潔淨室設施中進行並且必須進行額外的載體釋放測試。慢病毒載體通常通過使用大量質粒DNA的瞬時轉染產生；使它們比使用穩定包裝細胞系產生的逆轉錄病毒載體更昂貴[31,32]。開發用於慢病毒載體生產的穩定包裝細胞系，例如WinPac，可以降低這種成本[33]。此外，病毒載體需要對複製型病毒進行昂貴的測試，導致每位患者花費數萬美元[31]。逆轉錄病毒和慢病毒的產生已在其他地方詳細審查[34]。

3.2基於質粒的基因傳遞

CAR基因遞送的一種相對較新的方法是使用轉座子/轉座酶系統。轉座子是一系列DNA，能夠通過轉座酶切除和插入改變基因組內的位置[35]。可以將CAR轉基因插入質粒上的轉座子序列中，轉座酶在轉座子內編碼或單獨編碼。在激活之前將質粒電穿孔到T細胞中，然後轉座酶切除含CAR的轉座子並將序列插入T細胞基因組[26,36,37]。與裸DNA的電穿孔相比，發現轉座子系統的使用提高了基因整合的效率，使效率更接近於病毒轉導的效率[16]。

睡美人（SB）轉座子/轉座酶系統已用於生產CAR T細胞。這種基因傳遞方法消除了對臨床級病毒載體產生的要求，並且相對便宜[31]。一個缺點是產生所需細胞數的培養時間高於病毒轉導的CAR T細胞[36]。值得注意的是，與病毒基因傳遞方法一樣，基因的插入可導致其他相關基因的發生或破壞[38]。然而，在最近的一項研究中，與病毒方法和piggyBac轉座子/轉座酶系統相比，SB基因整合到T細胞中被認為是插入腫瘤發生機率最低的方法[39]。首次住院使用SB轉座子/轉座酶系統進行CAR T細胞治療已顯示出有希望的結果[26,37]。

3.3目前臨床試驗中的基因遞送

病毒轉導是最常見的基因遞送方法，其中919種可評估的產品中有919種（圖3）。慢病毒轉導在521種產品中佔主導地位，而逆轉錄病毒轉導是第39種產品中使用次數最多的方法。使用這兩種方法，可以產生具有高轉導效率的安全有效的產品，但它們有些昂貴。簡單質粒DNA轉染的早期研究產生的臨床效果不佳[9,10,40]。基於轉座子/轉座酶系統（即SB系統，見上文）的方法最近進入診所治療39名患者。如果可以證明使用這種途徑創造安全有效的產品是可行的，這種方法對於CAR T細胞療法領域變得特別有意義，因為基於轉座子/轉座酶的基因遞送提供了超過病毒轉導的顯著經濟優勢[31]。

圖3目前的CAR T細胞生產路線。

4.擴增

4.1 T型燒瓶和靜態培養袋

在轉導或轉染的CAR T細胞的擴增期間，改變培養體積。隨著細胞數量的增加，使用具有增加體積的血管或更多數量的血管，例如，多個組織培養板或燒瓶[9,10]。這是勞動密集型的，因為燒瓶需要由經過培訓的操作員在潔淨室或生物安全櫃（100級環境）中頻繁更換培養基[5]。使用組織培養板或燒瓶不適合大規模生產，因為它涉及多個開放處理步驟，並且作為現有技術的工業標準是不可接受的。靜態培養袋通常用於擴張（表1），並且可以通過管道以無菌方式連接。Tumaini等[41]開發了一種半封閉系統，通過使用連接的靜態培養袋，最大限度地減少了開放處理的相互作用。靜態培養袋相對容易實施，並且比組織培養瓶更適合製造，因為樣品和培養基轉移需要較少的手動開放處理，增加了安全性。

4.2搖擺運動生物反應器

搖擺運動（RM）生物反應器（例如WAVE生物反應器/Xuri細胞擴增系統）通過應用培養基灌注區域進一步最小化操作者的相互作用。灌注方案可去除生長抑制物質並確保恆定量的營養;因此，與靜態培養袋相比，培養體積更小[42]。Sadeghi等[43]發現使用RM生物反應器系統代替靜態培養袋擴大TILs可將勞動強度降低至33％，培養基消耗降至50％。有趣的是，已經觀察到使用RM生物反應器系統產生包含更多CD4+T細胞的最終產物[44]。對於這種類型的生物反應器來說，放大是一個挑戰，搖擺裝置的機械故障會導致批次故障[44]。Xuri技術提供（半）自動化生產的優勢。

4.3目前臨床試驗的擴增

在目前的細胞培養過程中，通常增加培養基體積;通常通過增加袋子或燒瓶的尺寸或通過從板到燒瓶，燒瓶到靜態培養袋或靜態培養袋換成RM生物反應器。擴展過程中的各種方法可分為三種方法。首先，使用平板或T-燒瓶（圖3中的「T-Flasks」）擴增679種可評估產品中的147種。這種方法對訓練有素的操作人員要求在安全櫃中以開放式處理方式製造產品的要求很高，通常每個產品使用多個燒瓶/板[5]。組織培養瓶和板特別用於較小的患者群組。237種產品在靜態培養袋中擴增，或者在燒瓶或平板中開始擴增後最終放大到靜態培養袋（圖3中的「靜態培養袋」）。使用較大的靜態培養袋進行放大而不是增加燒瓶或平板的數量具有許多優點。特別是，袋子可以無菌方式連接，減少了開放處理的步驟[41]。第三種方法採用最先進的技術。從袋子或燒瓶開始，擴增最終在RM生物反應器中進行，該生物反應器在灌注中運行。在679種可評估產品中有295種，RM生物反應器擴張方法佔主導地位，這是由於其在較大的患者隊列中的使用。

4.4目前臨床試驗中激活，基因遞送和擴增方法的常見組合

如圖3所示，在679種可評估產品中有295種（43％），搖擺運動（RM）生物反應器中珠子活化，病毒轉導和擴增的組合是最常見的生產方法（CTL019，JCAR014，JCAR017和JCAR018起主要作用）。第二種最常見的方法，129種產品（19％），用mAb/IL-2活化，病毒轉導和燒瓶擴增。這種方法是最手動和非自動化的生產策略。第三種最常用的是磁珠活化，病毒轉導和靜態培養袋中的擴增的組合（119種產品，18％）。我們的分析表明，整個培養過程通常持續20天（圖1）。

CAR-T細胞療法製造中的挑戰和新穎解決方案

1.信使RNA轉染和其他控制CAR功能的手段

在臨床試驗中測試新受體時，腫瘤外靶向毒性是潛在的致命風險[45]。減輕這些風險的解決方案包括T細胞的信使RNA（mRNA）轉染，因此它們僅以瞬時方式表達CAR，限制CAR毒性問題的影響[45,46,47]。已經顯示重複輸注mRNA可成功誘導患者的抗腫瘤活性[47]。另一種設計包括用於誘導細胞凋亡的藥物依賴性「殺傷開關」，可用於減輕長期腫瘤外毒性，如CD19-CARs中的B細胞發育不良[48]。該方法應用於臨床試驗NCT02028455，其中除了CAR之外，還用自殺構建體EGFRt轉導T細胞（Gardner等人2016，參見表2）[49]。其他設計已在其他地方進一步審查[50]。

2.可變性和缺乏確定的過程規模是主要挑戰

當前的過程使用各種技術，如已經討論的那樣，這些技術可以導致最終產品中子集組成的變化。另外，主要單採血液成分術產品對於每個患者而言各自不同。Brentjens等人[29]據報導，10名患者的擴張時間在23.6至385倍之間。有趣的是，擴張的兩個極端是在幾乎相同的培養時間內實現的。在18天內實現了23.6倍的擴增，在16天內實現了385倍的擴增，最終劑量分別為1.1*109和1.4*109個CAR T細胞。獲得的變化的膨脹率表明細胞的顯著不同和不可預測的行為。在所報導的轉導效率中，該過程的可變性也是顯而易見的。在同一項研究中，逆轉錄病毒轉導導致4-70％的效率[29]。郭等人[11]獲得的慢病毒轉導效率從5.5％提高到45.3％，其他組報告相似[51,52]。這種固有的可變性使得難以在研究和製造平臺之間進行比較。值得注意的是，CAR分子的設計因研究而異。有關CAR T細胞設計的詳細評論，讀者可參考Sadelain，Brentjens和Rivie，2013，Abate-Daga和Davila 2016以及Jaspers和Brentjens 2017[53-55]。

在臨床研究中，CAR T細胞劑量差異很大。最近具有有希望的結果的臨床試驗應用了106-107細胞/kg體重的預期劑量範圍（Sauter等人，2014。Park等人2013，2015。Schuster等人，2015a。Popplewell等人，2015）。李等人（2015）[56]報導了兩名接受低於計畫劑量的ALL患者的臨床結果。患者2接受0.03*106個CAR T細胞/kg體重，患者5接受0.48*106個CAR T細胞/kg體重，而不是1*106個CAR T細胞/kg體重。患者2實現了穩定的疾病，患者5實現了完全反應，即最小殘留疾病陰性。有趣的是，評估當天患者2和5中血液循環CAR T細胞的數量與接受正確劑量的患者沒有顯著差異。因此，只要在輸注後看到足夠的擴張，輸注低於預期的CAR T細胞劑量可以是治療有效的。

3.CAR T細胞療法的質量保證和控制（QA/QC）

目前公布的方案遵循當前良好生產規範（cGMP）關於安全性，純度和效力測試的指南[14,15,57]。關於安全性的釋放標準是無菌和不存在複製型病毒（在病毒轉導的細胞的情況下）。複製能力的逆轉錄病毒或慢病毒的存在通常用基於細胞的測定或定量聚合酶鏈反應（qPCR）測定進行測試[14,58]。

理想情況下，該產品具有高純度。特定細胞類型或亞群的富集或消耗可確保具有更高純度的起始材料（參見富集和消耗部分）。測試污染的細胞群，例如NK細胞也是有益的[15]。其他雜質是內毒素，支原體或該過程的殘留物，例如，激活可能造成傷害的珠子，例如，如果轉移到患者體內能夠激活內源性T細胞[14]。

該產品需要有效，通常通過評估轉導效率或通過體外細胞毒性試驗間接測試。CAR T載體拷貝數可以在過程中確定，並且是轉導效率的量度[14]。但是，拷貝數不一定反映CAR表達的水平。CAR陽性細胞的數量可以通過在生產結束時對CAR T細胞進行免疫表型分析來確定。為了檢測CAR，研究人員在轉基因中引入了標籤或開發了CAR特異性mAb[14,59]。一些中心在體外進行細胞毒性測定，例如鉻釋放測定。這些在生產結束後消耗時間和有價值的細胞。辛格等人[15]使用超過0.5*106個T細胞進行單一產品的鉻釋放測定。儘管可以使用方法來測試T細胞的效力，但是沒有使用標準化方法，使得難以在研究或平台上比較CAR T細胞效力。迄今為止，效力測定是QC期間CAR T細胞產物表徵的主要挑戰之一。這主要是由於CAR T細胞療法的作用方式的複雜性和缺乏標準化方法[60]。